ATTIVITA' DIAGNOSTICHE

DIAGNOSTICA ISTOLOGICA

La diagnostica istopatologica comprende circa 13000 casi  l' anno, con un incremento di circa il 10% annuo. Tale diagnostica viene effettuata sia con colorazioni istologiche di routine, sia con metodiche immunoistochimiche, sia con metodiche molecolari.

L' attività diagnostica di eccellenza è rappresentata dalle seguenti metodologie:

• Tecnica chirurgica di MOHS e MOHS modificata Tubingen
• Linfonodo sentinella in patologie neoplastiche della mammella e  cutanee
• Diagnostica istoenzimatica per malattia di Hirschsprung .
• Diagnostica molecolare per HPV e per Polyoma virus umani in pazienti trapiantati renali.

LA TECNICA CHIRURGICA DI MOHS (variante diretta)

La tecnica chirurgica di Mohs è un' approccio microtopografico alla dermochirurgia atta a verificare la radicalizzazione (n.d.r. escissione completa e radicale) di neoplasie dai limiti poco definibili.

Tale tecnica può incontrare ragionevole applicazione unicamente su neoformazioni cutanee a basso grado di metastatizzazione ed è indicata in regioni corporee ove è fondamentale risparmiare anche il più piccolo quantitativo di tegumento.
Per essere eseguita richiede una stretta e sinergica collaborazione fra il reparto di Dermochirurgia ed il servizio di Anatomia Patologica in quanto la parte diagnostica "in tempo reale" dà le eventuali fondamentali indicazioni al proseguo dell' intervento.

Tecnicamente al reparto di Anatomia Patologica spetta il compito di analizzare i campioni cutanei escissi durante l' operazione e celermente inviategli.

I lembi cutanei pervenuti in esame devono avere dimensioni e caratteristiche ben determinate (raggio non superiore ai 2 cm., assenza di calcificazioni o di corpi estranei) e devono essere accompagnati da un modulo di richiesta  adeguatamente compilato recante indicazioni di tipo topografico (Es: disegno della zona di exeresi con indicazioni delle chine utilizzate per colorare i margini di escissione).

I campioni in esame vengono trattati con una tecnica criogena, simile a quella utilizzata per gli esami intraoperatori, nella maniera che segue:

- i distinti lembi cutanei vengono fissati ed inclusi su dei particolari supporti grazie ad una particolare resina (OCT) avendo cura che l' epidermide sia rivolta verso il basso e l' ipoderma verso l' alto;

- i campioni così surgelati vengono sezionati su più livelli mediante un criostato al fine di ottenere un numero sufficiente di sezioni atte a rappresentare i vari livelli del tegumento in esame

- i vetrini così ottenuti vengono trattati con una colorazione specifica per gli esami intraoperatori (una variante della classica Ematossilina-Eosina adattata ai tempi molto più stretti della diagnosi estemporanea)

- i vetrini così allestiti giungono al microscopio dal patologo che segue il decorso del suddetto intervento e che dà indicazioni al chirurgo per l' eventuale escissione specifica di altri lembi cutanei.
Questi altri eventuali frammenti di tegumento subiscono lo stesso tragitto diagnostico dei campioni precedentemente analizzati sino alla completa e radicale escissione della neoplasia.

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IL LINFONODO SENTINELLA

Come linfonodo sentinella si definisce il primo linfonodo che drena un determinato distretto del corpo, sede della neoplasia primitiva, è quindi la prima struttura incontrata da eventuali cellule metastatiche lungo la via linfatica.

Poiché nella maggior parte dei casi la diffusione delle cellule maligne sembra seguire una certa sequenzialità,  il linfonodo sentinella è il primo linfonodo ad essere interessato in caso di metastatizzazione linfatica.
I linfonodi a valle saranno interessati solo successivamente e quindi l' eventuale negatività del linfonodo sentinella depone per la negatività dell' intera stazione linfonodale.

L' esame del linfonodo sentinella dovrebbe perciò permettere di selezionare i pazienti con localizzazioni metastatiche linfonodali occulte dai pazienti senza metastasi linfonodali.

La tecnica si basa sulla inoculazione o sottocutanea nell' area di proiezione cutanea della neoplasia, o intratumorale di una sostanza radioattiva e/o di un colorante vitale che poi migrano attraverso i linfatici verso i linfonodi regionali.

Le modalità e le quantità sia di tracciante radioattivo che di colorante vitale da utilizzare sono standardizzate.

Il linfonodo sentinella (o i linfonodi sentinella, se sono stati reperiti più di un linfonodo),una volta asportato viene inviato al laboratorio di Anatomia Patologica, a fresco se si richiede l' esame estemporaneo intraoperatorio o in formalina 10% se si richiede solo l' esame definitivo.

Macroscopicamente il linfonodo presenta una colorazione bluastra.

Nel nostro laboratorio questa tecnica viene eseguita solo su materiale fissato seguendo due protocolli: uno per il carcinoma della mammella, l' altro per il melanoma cutaneo.

LINFONODO SENTINELLA DELLA MAMMELLA

Si localizza nel cavo ascellare .Nella nostra realtà il linfonodo perviene al laboratorio insieme al quadrante mammario. Viene fissato in formalina 10% e si eseguono sezioni trasversali di circa 2 mm di spessore, se possibile il linfonodo si include tutto in un solo blocchetto.

E' molto importante preservare l' integrità della capsula linfonodale nel sezionarlo per vedere il seno marginale dove si collocano la maggior parte delle micrometastasi.

Al taglio al microtomo vengono allestite numerose sezioni alcune colorate in ematossilina-eosina ed altre con reazione immunoistochimica per le pancitocheratine.

Esistono diversi protocolli di taglio, quello da noi seguito prevede vari livelli ottenuti con uno scarto di 150 micron tra uno e l' altro fino ad esaurimento del materiale. Ciascun livello prevede:

2EE

scarto 50 micron

2EE

scarto 50 micron

2IIC (AE1/AE3)

LINFONODO SENTINELLA DEL MELANOMA

Il linfonodo fissato in formalina 10% viene tagliato in due metà in corrispondenza dell' ilo, lungo l' asse maggiore.

Se pervengono più linfonodi si procede in modo analogo per ciascun linfonodo identificato dalla colorazione bluastra.

Si include sempre tutto il linfonodo. Il protocollo di taglio prevede per ciascuna inclusione in paraffina l' allestimento di 10 sezioni, di cui la prima e la sesta colorate con metodo immunoistochimico con l' anticorpo anti-proteina S100 e tutte le altre vengono colorate con ematossilina-eosina.

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                           DIAGNOSTICA ISTOENZIMATICA DEI DIFETTI DI INNERVAZIONE AUTONOMA INTESTINALE

(MORBO DI HIRSCHSPRUNG)

La diagnosi della malattia di Hirschsprung (HD) si basa su elementi clinici, strumentali ed istologici. Questi ultimi comprendono:

• valutazione della presenza/assenza dei gangli nervosi parasimpatici nel plesso sottomucoso e/o in quello mioenterico in un tratto di colon di lunghezza varia, da pochi cm dalla rima anale a tutta l' estensione del colon
• valutazione della morfologia e grado di maturazione dei gangli
• valutazione della presenza e distribuzione delle fibre nervose colinergiche
• valutazione della morfologia e localizzazione del plesso mioenterico.

Salvo casi particolari, tali valutazioni possono essere eseguite su biopsie per suzione, con minimo traumatismo per il paziente, senza anestesia ed in regime ambulatoriale. 
Questi prelievi, inviati immediatamente dopo l' esecuzione in appositi contenitori chiusi con all' interno garza imbevuta di soluzione fisiologica, vengono congelati in ghiaccio secco anidro.
Al momento della processazione, si scongelano, si orientano su supporti da criostato in modo che le sezioni comprendano mucosa e sottomucosa e si ricongelano in ghiaccio secco anidro.

La diagnosi certa di HD e disordini correlati si basa sull' uso di metodiche di istochimica enzimatica, le quali forniscono indicazioni certe sulla presenza/assenza e tipologia della lesione. Per questo motivo, si eseguono circa 30 sezioni "a catenella" dello spessore di 16 mm, su ogni vetrino. Dopo asciugatura, si applicano le seguenti colorazioni isto-enzimatiche: ACE (acetil-colinesterasi), LDH (lattico-deidrogenasi), SDH (succinico-deidrogenasi), NADPH (nitrato ossido-sintetasi) e la colorazione istochimica Syrius-Red. Si passa quindi alla valutazione microscopica dei preparati ed alla diagnosi conclusiva.

Nella nostra esperienza, tale metodica è risultata altamente sensibile e specifica, fornendo indicazioni importanti per il trattamento successivo del paziente ed attualmente risulta l' unica in grado di fornire una diagnosi certa sulle patologie da disordini dell' innervazione autonoma intestinale.

ESAMI DI DIAGNOSTICA MOLECOLARE

Ricerca Polyomavirus (BKV, JCV ed SV40) su tessuto, sangue, urine,  liquor

• Estrazione del DNA virale da tessuto, sangue, liquor
• Amplificazione genica (Multiplex/nPCR)  del DNA virale
• Elettroforesi del prodotto di PCR                                                 

Ricerca Mycobacterium tubercolosis su tessuti e liquidi (escreato, BAL, urine)

• Estrazione del DNA batterico da tessuto
• Amplificazione genica (nPCR)  del DNA batterico
• Elettroforesi del prodotto di PCR

 Ibridazione in situ su tessuto paraffinato (ISH) e conseguente tipizzazione

• Ibridazione con sonda molecolare a DNA W-spectrum (genotipi evidenziati: 6,11,16,18,30,31,33,35,45,51)
• Sui casi positivi: ibridazione con sonde molecolari a DNA specifiche: 6,11 (basso rischio oncogeno), 16-18 e 31-33 (alto rischio oncogeno)

ATTIVITA' AUTOPTICA

L' attività autoptica comprende circa 90 riscontri dignostici/anno effettuati dal personale medico.
Parte di questi riscontri viene effettuata ad uso esercitativo  per studenti della facoltà di medicina e per lauree specialistiche.